رزین های تبادل یونی برای جداسازی پروتئین از لبنیات

رزین های تبادل یونی برای جداسازی پروتئین از لبنیات مورد استفاده قرار می گیرند. توجه داشته باشید خالص‌ سازی پروتئین با استتفاده از رزین های تبادل یونی امکان‌پذیر است زیرا اکثر پروتئین‌ها بارهای الکترواستاتیکی خالص غیر صفری را در تمام pH ها به جز در pH=pI (نقطه ایزوالکتریک) تحمل می‌کنند. در pH > pI یک پروتئین معین، آن پروتئین دارای بار منفی می شود (یک آنیون)، در pH<pI همان پروتئین، دارای بار مثبت (یک کاتیون) می شود.

کروماتوگرافی تبادل یونی به دلیل جاذبه الکترواستاتیکی بین پروتئین‌های باردار محلول در بافر و محل‌ های اتصال با بار مخالف روی یک جاذب تبادل یون جامد رخ می‌دهد. جاذب تبادل یونی (که به آن رسانه، رزین، ژل یا ماتریکس نیز می‌گویند) معمولاً از دانه‌ های خنثی متخلخل کروی با گروه‌ های باردار (گروه‌های عملکردی) به صورت متراکم بر روی سطوح مهره‌ها پیوند می‌شوند. بارهای گروه های عاملی توسط یون های ضد آزاد خنثی می شوند.

مراحل کلی برای خالص سازی کروماتوگرافی تبادل یونی مخلوط پروتئین به بافر با قدرت یونی کم (فاز متحرک) منتقل می شود. رزین تبادل یونی (فاز ثابت) در یک ستون بسته بندی می شود و ستون از قبل با بافر با pH یکسان و قدرت یونی مشابه مخلوط پروتئین (ترجیحاً همان بافر مخلوط پروتئین) متعادل می شود. مخلوط پروتئین روی ستون اعمال می شود. پروتئین هایی که توسط رزین تبادل یونی باردار شده اند به طور موقت در ستون باقی می مانند. تمام پروتئین های دیگر به سادگی از ستون عبور می کنند و در این مرحله جمع آوری می شوند.

پروتئین های باقی مانده با استفاده از یک بافر اصلاح شده از ستون شسته می شوند. شستشو معمولاً با افزایش تدریجی قدرت یونی بافر از طریق محلول نمک حاصل می‌شود و پروتئین‌ ها به منظور افزایش بار خالص آنها شسته می‌شوند. در موارد خاص، شستشو را می توان با تغییر pH و روش های میل ترکیبی انجام داد. کروماتوگرافی تبادل یونی می تواند جداسازی با وضوح بالا را برای پروتئین هایی با علامت یکسان اما بار خالص کل مختلف فراهم کند. با توجه به ظرفیت بالای اکثر مبدل‌ های یونی، این تکنیک همچنین می‌تواند برای گرفتن مخلوطی از پروتئین‌های باردار با علامت مشابه از نمونه‌های رقیق‌شده با حجم زیاد استفاده شود، سپس پروتئین‌ها در حجم نمونه به میزان قابل‌توجهی کاهش یافته شسته می‌شوند.

رزین های تبادل یونی برای جداسازی پروتئین از لبنیات

به دلیل کاربردهای ویژه پروتئین در زمینه تغذیه، دارو، آرایشی نیاز به جداسازی پروتئین از لبنیات با استفاده از رزین های تبادل یونی افزایش چشمگیری داشته است. پروتئین هایی مانند لاکتوفرین و لاکتو پراکسیداز را می توان از شیر بدون چربی یا مشتقات آب پنیر تهیه کرد.

پروتئین های مهم لبنیات

• لاکتوپراکسیداز
• α-لاکتالبومین
• ایمونوگلوبو لین ها (IgG)
• لاکتوگلوبولین
• آلبومین سرم گاوی (BSA)
• گلیکوماکروپپتیدها (GMP)

 

• لاکتوپراکسیداز نقش مهمی در محافظت در برابر میکرو ارگانیسم های بیماری زا ایفا می کند و همچنین در تخریب انواع سلول های سرطان زا مورد استفاده قرار می گیرد. در سلول های جانوری از اثرات پراکسیداتیو محافظت می کند، که می تواند باعث تغییر در سیگنال دهی سلولی، آسیب پروتئین و DNA و سمیت سلولی شود. این ویژگی‌های عملکردی، لاکتوپراکسیداز را در طیف گسترده‌ای از بخش‌ها، مانند صنایع لبنی، آرایشی، دارویی، دامپزشکی و کشاورزی مورد توجه قرار می‌دهد.
• α-لاکتالبومین  یک متالوپروتئین کلسیم است که سنتز لاکتوز را در غده پستانی تنظیم می کند. این پروتئین دومین پروتئین فراوان در آب پنیر است و به مقدار زیاد در شیر مادر یافت می شود. α-لاکتالبومین در حال حاضر به صورت تجاری در مکمل های شیر خشک برای نوزادان استفاده می شود و می تواند به عنوان منبع اسیدهای آمینه ضروری مورد استفاده قرار گیرد. نشان داده شده است که عملکرد مغز را بهبود می بخشد و استرس و افسردگی را کاهش می دهد.
• ایمونوگلوبو لین ها (IgG)  مولکول های گلیکوپروتئینی هستند که با اتصال به آنتی ژن های خاص مانند ویروس ها، باکتری ها و سموم به عنوان بخش مهمی از پاسخ ایمنی عمل می کنند. IgG ها در غلظت های بالا در آغوز یافت می شوند و علاقه روزافزونی به کاربرد آنها در مواد غذایی درمانی و کاربردی وجود دارد.
• لاکتوگلوبولین یک پروتئین اصلی آب پنیر است که در شیر گاو یافت می شود و 58 درصد از پروتئین آب پنیر شیر را تشکیل می دهد. به دلیل ترکیب آمینو اسیدی با کاربردهای امیدوارکننده در نقش های بیولوژیکی بیشتر، ارزش غذایی بالایی دارد. لاکتوگلوبولین به عنوان پروتئین انتقالی برای مولکول های کوچک مختلف از جمله پلی فنول ها و رتینول ها استفاده می شود.
• آلبومین سرم گاوی (BSA)  یک پروتئین آلبوم سرم است که در گاوها یافت می شود. به دلیل پایداری و عدم تداخل با واکنش های بیولوژیکی در کاربردهای بیو شیمیایی متعددی استفاده می شود. خالص سازی کروماتوگرافی BSA به طور معمول یک پروتئین بومی بسیار حفاظت شده نسبت به روش های دیگر تولید می کند.
• گلیکوماکروپپتیدها (GMP)  پپتیدهای مشتق شده از شیر هستند که از k-casein در طی فرآیند ساخت پنیر آزاد می شوند. فعالیت های ارتقا دهنده سلامت این پپتید آب پنیر شامل ضد میکروبی، پری بیوتیک و تعدیل کننده ایمنی است. این پپتید 15 تا 20 درصد پروتئین های موجود در آب پنیر را تشکیل می دهد و آن را در رتبه سوم فراوان قرار می دهد.

رزین پرولایت برای تصفیه لاکتوفرین

کروماتوگرافی تبادل کاتیونی – پایه آگارز	کاربرد
SP200	مبدل کاتیونی قوی Agarose Highly Cross Linked، اندازه ذرات 200 میکرومتر

نکات مهم فرآیند رزین های تبادل یونی برای جداسازی پروتئین از لبنیات

قبل از بارگیری مخلوط پروتئین در ستون، مکان های باردار روی پروتئین ها و گروه های عاملی مبدل یونی توسط یون های ضد بافر متعادل می شوند. هنگامی که پروتئین ها به رزین های تبادل یونی جذب می شوند، این یون های بافر آزاد می شوند (پالسی از نمک های بافر اضافی تشکیل می شود): 1 میلی گرم بر میلی لیتر پروتئین جذب شده به طور کلی 1 میلی مولار نمک بافر اضافی آزاد می کند. بنابراین، در حالی که بخشی از مخلوط پروتئین جذب می شود، پروتئین های باقی مانده در محلول در معرض افزایش قدرت یونی (جذب بیشتر را مهار می کند) و تغییرات pH (ممکن است باعث آسیب پروتئین شود) قرار می گیرند که برای به حداقل رساندن تاثیر قدرت یونی و تغییرات pH در طول بارگذاری لازم است غلظت مصرفی پروتئین های جاذب کمتر از 5 میلی گرم در میلی لیتر باشد، در حالی که غلظت کل پروتئین در مخلوط بارگیری شده نباید از 15 میلی گرم در میلی لیتر تجاوز کند. حداقل 10 میلی مولار بافر، به طور ایده آل در 0.3 واحد از pKa آنها (حداکثر در 0.5 واحد pKa)، باید در طول بارگذاری استفاده شود. حداکثر غلظت بافر نباید از 50 میلی مولار تجاوز کند. در هر زمان، pH واقعی در محیط های میکرو مبدل های یونی می تواند تا 1 واحد pH متفاوت از pH بافر اعمال شده باشد. به همین دلیل باید مراقب بود که پروتئین های مورد نظر در pH واقعی “نتیجه” پایدار داشته باشند.

گروه‌های عملکردی رزین های آنیونی، پروتئین ها را جذب می‌کنند و آنیون‌ های هیدروکسیل را از محلول‌های آبی دفع می‌کنند و باعث pH اسیدی‌ تر در نزدیکی محل‌های اتصال پروتئین می‌شوند. عوارض در یک حالت ایده آل، پروتئین ها منحصراً توسط نیروهای الکترواستاتیکی در pH مورد انتظار به مبدل یون جامد جذب می شوند. در موارد غیر ایده آل، دنیای واقعی عوامل کمپلکس کننده پلی یونی مانند EDTA به گروه های عاملی با بار مثبت در مبدل های آنیونی متصل می شوند و به صورت جامد تجمع می یابند و بنابراین از اتصال پروتئین جلوگیری می کنند. حرکت پروتئین به پایین ستون را می توان با جذب آبگریز و پیوند هیدروژنی پروتئین به مواد مبادله کننده یون کند کرد. جذب آبگریز (جذب آبگریز فرآیندی است که در آن مولکول های آب به سطح یک ماده جامد جذب می شوند. این فرآیند می تواند به دلیل نیروهای مختلفی از جمله پیوندهای هیدروژنی، نیروهای واندروالس و پیوندهای یونی رخ دهد.) ممکن است باعث اتصال برگشت ناپذیر یا دناتوره شدن در طول مرحله شستشو شود. (این امر به دلیل آن است که مولکول های آب می توانند به گروه های عملکردی پروتئین ها متصل شوند و باعث تغییر شکل یا دناتوره شدن آنها شوند.) برای کاهش جاذبه های آبگریز، می توان 10 درصد استونیتریل را به بافر اضافه کرد. بارهای سطحی مختلف بر روی پروتئین ها می توانند به طور نابرابر توزیع یا غیرقابل دسترسی باشند. در چنین مواردی، پروتئین‌ها ممکن است در pH تا pI+1 به مبدل‌های کاتیونی جذب شوند (pH تا pI-1 برای مبدل‌های آنیون)، یا پروتئین‌ها ممکن است در pH «مورد انتظار» به فاز جامد متصل نشوند.

نامگذاری

در کروماتوگرافی تبادلی کاتیونی ، پروتئین‌های با بار مثبت (کاتیون‌ها) به محیط جامد با بار منفی جذب می‌شوند (کاتیون‌های بافر که در اصل بارهای منفی روی محیط جامد را متعادل می‌کنند توسط کاتیون‌های پروتئینی «مبادله» می‌شوند). در کروماتوگرافی تبادل آنیونی ، پروتئین‌های با بار منفی (آنیون‌ها) به محیط جامد با بار مثبت جذب می‌شوند (آنیون‌های بافر که در اصل بارهای مثبت را در محیط جامد متعادل می‌کنند توسط آنیون‌های پروتئینی «مبادله» می‌شوند).

مبدل آنیون	مبدل کاتیونی	نوع جاذب تبادل یونی:
مثبت	منفی	گروه های عملکردی مبدل یونی شارژ می شوند
منفی (پروتئین یک آنیون است)	مثبت (پروتئین یک کاتیون است)	هزینه خالص پروتئین مورد علاقه
> pI + 1	< pI – 1	pH بافر توصیه شده
تا 1 واحد بالاتر از pH بافر	تا 1 واحد کمتر از pH بافر	pH حاصل در مجاورت فاز جامد (اثر دانان)

رزین های تبادل یونی معمولاً به عنوان «ضعیف» یا «قوی» طبقه بندی می شوند. این طبقه بندی به این واقعیت اشاره دارد که گروه های عاملی در بسیاری از جاذب های تبادل یونی، بار خود را فقط در یک بازه زمانی مشخص از pH حفظ می کنند. گروه‌های عملکردی در مبدل‌های یونی قوی در  pH وسیع‌تر نسبت به مبدل‌های یونی ضعیف، شارژ می‌شوند. طبقه بندی ضعیف/ قوی به توانایی جاذب برای اتصال پروتئین ها اشاره نمی کند، بلکه فقط به مقدار pKa گروه های عاملی آنها اشاره دارد.

رزین تبادل یونی برای خالص سازی پروتئین IE

توجه داشته باشید پلیمرهای کربوهیدرات طبیعی – دکستران، سلولز، آگارز – به طور گسترده ای برای خالص سازی پروتئین استفاده می شود. مزیت اصلی آنها ویژگی آب دوستی آنها است که منجر به جذب کم و غیر اختصاصی می شود. چنین پلیمرهایی دارای چگالی جامد کم (بیش از 90 درصد آب) و استحکام مکانیکی محدودی هستند و بنابراین از اتصال متقاطع شیمیایی برای دستیابی به پایداری مکانیکی مناسب استفاده می‌شود. پایداری مکانیکی بالا را می توان برای پلیمرهای مصنوعی (چگالی جامد بالاتر، 50-80٪ آب) به دست آورد، با این حال، همه آنها یک نقطه ضعف مشترک در تصفیه پروتئین دارند – آبگریزی نسبی، افزایش به ترتیب:

پلیمرهای کربوهیدرات طبیعی <کوپلیمرهای آکریل آمید/وینیل <پلیمرهای متاکریلات <کوپلیمرهای استایرن/دیوینیل بنزن.

دانه های رزین که دارای ساختاری مبتنی بر استایرن/دیوینیل بنزن به دلیل اتصال غیر اختصاصی بالا و بازیابی کم برای بسیاری از تصفیه های پروتئینی مناسب نیستند. با توجه به اینکه برای پوشاندن دانه‌های استایرن با پوشش‌های آبدوست انجام شده بود اما رزین هایی مبتنی بر استایرن/دیوینیل بنزن (منبع، POROS و غیره) بیشتر برای کاربردهایی به جز تصفیه پروتئین مناسب تر هستند.

ماهیت و غلظت بافر

بار پروتئین (هر دو موضعی و خالص)، پایداری و گاهی ترکیبات وابسته به pH هستند. به این ترتیب، برای جلوگیری از تغییرات pH در ریز محیط‌های ستون، شکل باردار بافر در حالت ایده‌آل باید علامتی مشابه با گروه‌های عاملی در مبدل یونی داشته باشد.

قدرت اتصال پروتئین در طول کروماتوگرافی تبادل یونی وابسته به pH است و با افزایش قدرت یونی محلول بافر کاهش می یابد. یک بافر ظرفیت بافری بیشتری (PH تثبیت کننده و بنابراین قدرت اتصال پروتئین) را در غلظت بالاتری از خود بافر فراهم می کند. یک بافر ایده آل بافری است که ظرفیت بافری بالایی را فراهم میکند و در عین حال اتصال پروتئین را بیش از حد کاهش ندهد. به این ترتیب، بهترین بافر نوعی است که با افزایش غلظت بافر، قدرت یونی آن کمترین افزایش را داشته باشد.

برای به حداقل رساندن قدرت یونی بافر باید به نکات زیر توجه کرد

• غلظت بافر باید 10-20 میلی مولار باشد،
• فقط یکی از دو گونه بافر باید شارژ شود ، دیگری خنثی است.
• بافر باید به گونه ای تهیه شود که آب تشکیل شود نه نمک

لطفاً توجه داشته باشید که این اطلاعات مجموعه‌ای از دستورالعمل‌ها است و استثنائاتی نیز ممکن است. به عنوان مثال، بافر فسفات، H 2 PO 4 -1 = H + + HPO 4 -2 (نوعی بافر HA -1 = H + + A -2 ) برای خالص سازی تبادل آنیونی آنزیم ها به دلیل وجود آنزیم ها استفاده شده است. به بهترین نحو توسط بافر گفته شده تثبیت می شود.

در رقت، pH و pKa بافر است	نمونه های آماده سازی	ارتباط بین غلظت بافر C و قدرت یونی I در pH=pKa	در کدام نوع تصفیه تبادل یونی، کره باید به طور ایده آل استفاده شود	نوع بافر
افزایش یافت	بله: CH 3 COOH + 0.5 NaOH = 0.5 CH 3 COOH + 0.5 CH 3 COONa +  0.5H 2 O ( آب تشکیل می شود)خیر: CH 3 COONa + 0.5 HCl = 0.5 CH 3 COONa + 0.5 CH 3 COOH  + 0.5N نمک تشکیل می شود)	I ≈ 0.5*C با افزایش غلظت بافر C، قدرت یونی I بیش از حد افزایش نمی یابد، که خوب است	تبادل کاتیون – اینها بهترین بافرها هستند	HA = H + + A -1 یک  گونه خنثی
به شدت افزایش یافته است	بله: NaH 2 PO 4  + 0.5NaOH = 0.5NaH 2 PO 4  + 0.5Na 2 HPO 4  +  0.5H 2 O ( آب تشکیل می شود)خیر: Na 2 HPO 4  + 0.5HCl = 0.5Na 2 HPO 4  + 0.5N PO 4  +  0.5 NaCl ( نمک تشکیل می شود)	I ≈ 2*C با افزایش غلظت بافر C، قدرت یونی I کمی افزایش می یابد که بهینه نیست.	تبادل کاتیونی – اینها بافرهای قابل قبولی هستند	HA -1 = H + + A -2 هر دو گونه  شارژ می شوند
بسیار شدید افزایش یافته است		I ≈ 4.5*C با افزایش غلظت بافر C، قدرت یونی I به طور چشمگیری افزایش می یابد که به سختی قابل قبول است.	تبادل کاتیونی – اینها بافرهای به سختی قابل قبول هستند	HA -2 = H + + A -3 هر دو گونه  دارای بار زیادی هستند
کاهش یافته	له: Tris + 0.5HCl = 0.5Tris + 0.5Tris*HCl +  0.5H 2 O ( آب تشکیل می شود)خیر: Tris*HCl + 0.5NaOH = 0.5Tris*HCl + 0.5Tris +  0.5NaCl ( نمک تشکیل می شود)	I ≈ 0.5*C با افزایش غلظت بافر C، قدرت یونی I بیش از حد افزایش نمی یابد، که خوب است	تبادل آنیون – اینها بهترین بافرها هستند	HA + = H + + A یک   گونه خنثی
به شدت کاهش یافت		I ≈ 2*C با افزایش غلظت بافر C، قدرت یونی I کمی افزایش می یابد که بهینه نیست.	تبادل آنیون – اینها بافرهای قابل قبولی هستند	HA +2 = H + + A + هر دو گونه  شارژ می شوند

منبع: https://www.reachdevices.com/Protein/ProteinPurification

https://www.purolite.com/index/healthcare-and-life-sciences/nutraceuticals/dairy-protein-purification